华中科技大学学报(医学版)

作者：曹淳,陈耀,何佳佳,张毛雪,钱正韬,周小明

单位：江苏大学医学院基础医学与医学技术学院,镇江 212013

关键词：AAVS1, CRISPR, ZFN, TALEN, 基因编辑,

基金：国家自然科学基金资助项目(No.81571546)

摘要:目的 利用ZFN 与 TALEN 基因编辑以及同源重组技术将 Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真核细胞筛选标记的 DNA 超长片段定点插入 HEK-293T 细胞基因组 AAVS1安全港,建立可用于衡量 CRISPR-Cas9基因编辑的稳定 细 胞 株。方 法 利 用 分 子 克 隆 技 术 构 建 AAVS1-all-in-one-CRISPR 质 粒。利 用 脂 质 体 将 识 别 并 切 割AAVS1基因组序列的ZFN 和 TALEN 质粒以及 AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒共转染入 HEK-293T细胞。使用嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞后,利用杀稻瘟菌素S筛选、红色荧光检测、Cas9 Westernblot以及基因组 PCR 鉴定等方法获得 CRISPR-Cas9基因编辑报道系统完整整合入 AAVS1安全港的稳定细胞株。继而,将 EGFP修复模板单链 DNA 及EGFPsgRNA 瞬时转染入这些稳定细胞株,对失去荧光的 EGFP进行基因编辑,恢复其发光功能,并通过荧光检测技术验证基因编辑结果。结果 成功获得3株同时具有嘌呤霉素和杀稻瘟菌素 S抗性以及表达红色荧光蛋白的单克隆细胞,Westernblot证实其成功表达 Cas9蛋白,基因组 PCR 鉴定目的基因成功整合入基因组 AAVS1位点。经 EGFP基因编辑后,细胞恢复绿色荧光。结论 利用 ZFN 与 TALEN 将完整的 CRISPR-Cas9基因编辑报道系统成功整合入HEK-293T细胞基因组的 AAVS1安全港,整合 DNA 片段长度达11.5kb,并利用 Cas9成功编辑 EGFP报道基因。

来源：2022年第6期

《华中科技大学学报(医学版)》期刊编辑部

查看华中科技大学学报(医学版)杂志2022年第6期